L'utilisation du microscope optique en mycologie et lichénologie
Les produits chimiques utiles en microscopie
Jean-Pierre GAVERIAUX

01. Les milieux d'observation
02. Les milieux de réhydratation et de ramollissement
03. Les milieux de dissociation
04. Les fixateurs et milieux d'inclusion
05. Les deux colorants indispensables
06. Les colorants occasionnels
07. Les réactifs de Lugol et Melzer
08. Quelques colorants - réactifs spécifiques
09. La coloration vitale
10. Les milieux de conservation (milieu de montage permanent)
11. L’huile à immersion

a) Le Bleu de toluidine en solution à 1% dans l’eau bidistillée a été utilisé par GRUBE (1993) pour étudier les asques et les hyphes végétatives des thalles lichéniques.  

b) La phloxine B : est un colorant synthétique, fabriqué à partir d’hydrocarbures issus du goudron de houille. En solution aqueuse à 2%, la phloxine B colore en rouge le cytoplasme des cellules mortes, sans colorer les parois des hyphes et les cloisons.  

La phloxine B peut être utilisée en mélange avec d’autres colorants. En association avec le rouge Congo elle permet la double coloration. Déposer sur une lame une petite goutte de Congo puis à proximité une petite goutte de phloxine ; mélanger avec une épingle et y placer la coupe à colorer. Mettre une lamelle et dissocier par tapotements successifs. Il y a ainsi coloration des parois des hyphes par le Congo et du contenu des cellules par la phloxine. L’introduction de potasse à 5% permet, si nécessaire, d’éclaircir la préparation pour faciliter les observations (il n’est toutefois pas possible de prolonger l’observation très longtemps car la phloxine devient rapidement noirâtre en présence de KOH). 

Composition de la Phloxine B :

Phloxine B..................................................... 2 g
Eau bidistillée .............................................  100 mL
SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) ....................  1 g

Préparation : dissoudre en agitant 2 g de phloxine B dans 100 mL d’eau bidistillée ; ajouter 1g de Sodium Dodécyl Sulfate (SDS), un agent tensioactif anionique qui facilite la pénétration de la phloxine dans le cytoplasme. Le SDS ne doit toutefois pas être utilisé en présence de KOH (formation de précipités). 

c) Le soudan III permet de colorer les inclusions lipidiques (guttules) trouvées fréquemment dans les ascospores. Le soudan III est soluble dans des solvants de type white spirite mais n’est pas facilement miscible à l’eau ; son utilisation en mycologie/lichénologie pose donc des problèmes, l’eau étant le principal constituant des êtres vivants.

On peut utiliser le soudan III en solution alcoolique saturée mais l’éthanol provoque un rétrécissement important des structures cellulaires.

Préparation selon Erb et Mattheis : Faire une solution saturée de soudan III dans un mélange à part égales d’eau et de chloral hydraté. Pour atteindre la concentration nécessaire de 0,1 à 0,2% de soudan III, il faut placer le flacon contenant le mélange pendant au moins 2 jours sur l’agitateur magnétique (la dissolution est très lente) ; faire ensuite une filtration.

Préparation selon M. Langeron : Faire bouillir dans un erlenmeyer à col étroit, un excès de soudan III dans du lactophénol ; filtrer après refroidissement.

Composition et préparation du Soudan III dans le lactophénol :

- Préparer le lactophénol dans un ballon avec l’agitateur magnétique.
Eau bidistillée ...................  20 mL
Glycérine .......................... 40 g (33,3 mL)
Acide lactique ...................  20 g (16,6 mL)
Phénol .............................  20 g
- Quand l’ensemble est homogène et transparent, ajouter le colorant en excès.
Soudan III .........................  1 g
- Couvrir l’erlenmeyer d’un verre de montre.
- Agiter jusqu’à intégration du colorant au lactophénol.
- Porter à ébullition douce quelques minutes.
- Laisser refroidir et filtrer.