1. les produits pour les réactions
colorées thallines

------------

2. les réactifs pour l'étude des
structures microscopiques

-------------

3. les réactifs pour les
microcristallisations

------------

4. les produits pour la
chromatographie

2ème partie - Les produits pour les observations microscopiques

◄

Montage dans le chloral lactophénol après coloration au bleu coton C4B

Asque et spores multiseptées

de Zwakhia viridis

Montage au bleu lactophénolé

Conidies de Cetraria tubulosa

Montage au bleu coton lactophénolé

Les colorants bleus

Le bleu coton = bleu de méthyle = bleu C4B

Ce colorant est le meilleur bleu d’aniline utilisable en mycologie et lichénologie. Il est spécifique de la chitine, de la callose et du collagène. Il colore principalement la chitine présente dans les parois des hyphes. Chez de nombreux Ascomycètes il met également en évidence l’ornementation sporale (qualifiée alors de cyanophile) souvent caractéristique des espèces.

a) Le bleu coton lactique

C'est l'un des colorants les plus utilisé en lichénologie, l’acide lactique préserve les structures fongiques et le bleu C4B colore les parois des hyphes (contenant de la chitine et de la callose) mais aussi leur contenu (à un degré moindre toutefois en fonction de la teneur en collagène) ; c'est aussi un colorant indispensable pour révéler les ornementations sporales.

Parfois la coloration est lente, suite à la présence d'acide lactique visqueux ; il suffit dans ce cas de chauffer très légèrement la préparation afin de faciliter la pénétration du colorant et la dissociation.

On le prépare en ajoutant tout simplement le bleu de méthyle dans un peu d’acide lactique additionné de son volume d’eau.

Composition du bleu lactique :

Bleu de méthyle (= bleu coton) .................. 0,1 g
Eau bidistillée ................................ .........  20 mL
Acide lactique (S.G. 1.21) ........................ 20 mL

Préparation : dissoudre 0,1 g de bleu de méthyle dans 20 mL d'eau, ajouter les 20 g d'acide lactique officinal (specific Gravity 1.21).

b) Le bleu coton au lactophénol (= BCL) : 

Si on désire garder la préparation ou prendre des photographies, il est fortement recommandé d'utiliser le bleu coton au lactophénol qui présente 3 avantages :

- un indice de réfraction supérieur (les contours sont mieux définis) ;

- une viscosité plus importante qui limite fortement l'évaporation du milieu de montage ;

- la présence de phénol qui permet de tuer les micro-organismes éventuellement présents et provoque la désactivation de l’activité lytique des enzymes cellulaires ce qui permet une conservation beaucoup plus longue de la préparation.

Composition du réactif :

Bleu de méthyle (= bleu coton C4B) .....  0,1 g
Eau bidistillée ............................... .......  20 mL
Acide lactique (S.G. 1.21) ..................... 20 g
Glycérol ......................................  .......  40 g
Phénol ......................................  .........  20 g

Préparation : dissoudre 0,1 g de bleu de méthyle dans 20 g d'acide lactique officinal (specific Gravity 1.21) ajouter les 20 mL d'eau, les 40 g de glycérol puis les 20 g de phénol (produit très toxique à manipuler avec précautions sous la hotte reliée à l'extérieur).

Remarque 1 : parfois, la coloration est très lente à se développer (jusque 12 heures). Il est possible d’accélérer le processus en plaçant la préparation quelques temps sur une plaque chauffante afin de rendre la solution plus fluide (attention toutefois à ne pas porter à ébullition afin d’éviter la déformation des cellules). 

Remarque 2 : Après coloration au bleu coton lactophénolé, une teinte bleuâtre peut envelopper l’ensemble du champ. Il suffit alors de monter la préparation colorée dans du lactophénol. Seuls les éléments colorés restent nettement visibles, elles se détachent mieux du fond qui n'est plus bleuâtre mais parfaitement transparent, le contraste devient plus important ce qui facilite l’observation ou la photomicrographie.

Remarque 3 : le matériel monté dans le Bleu coton au lactophénol peut être conservé plusieurs mois en lutant la préparation. Il suffit de déposer un peu de vernis à ongle tout autour de la lamelle afin d’assurer l’isolement des structures et l’adhésion de la lamelle sur la lame ; deux couches de vernis sont généralement nécessaires (la deuxième après durcissement de la première).

Remarque 4 : ces colorants doivent être utilisés avec précautions, éviter les contacts avec la peau, avec les yeux, éviter de les respirer ; ce sont des substances toxiques et irritantes qui ne doivent pas être utilisées par des enfants ou des personnes non initiées à leur pratique.

Paraphyses septées de

Placynthium dolichiterum

Montage dans l'eau

Le bleu de crésyl brillant

Ce réactif surtout connu pour le phénomène de métachromasie peut également rendre de grands services en histologie lichénologique où il est capable de mettre en évidence certaines structures (à condition que les coupes réalisées soient très fines ou réalisées par exemple à l'aide d'un microtome). En solution aqueuse (couleur violette) ou alcoolique (couleur bleue), il est principalement utilisé en lichénologie pour l'étude des champignons lichénicoles et pour la mise en évidence des conidies.

c) Le bleu de crésyl en solution aqueuse

Eau bidistillée ............................................  100 mL
Bleu de crésyl ...........................................  0,1 à 1 g

En solution à 0,1-1% dans l’eau, le bleu de crésyl est utilisé par BARAL (1992 - Etude d’ascomycètes non lichénisés) et ROUX (1994-1995 - Etude de champignons lichénicoles non lichénisés).

Ces solutions sont également utilisées en mycologie pour mettre en évidence :
- la métachromasie de certaines spores, la spore est bordée de bleu, l'exospore reste incolore et l'endospore est pourpre (utilisé chez les lépiotes).
- les corps lipidiques : après coloration au bleu de crésyl, l'addition d'ammoniaque provoque une décoloration, seuls les corps lipidiques apparaissent colorés en jaune.

- certains éléments intra-cytoplasmiques et les gels localisés sur la surface externe des membranes.

 d) Le bleu de crésyl en solution alcoolique selon Clémençon (1972)

Bleu de crésyl ..................................................  0,25 g
Glycérine .........................................................  17 mL
Ehanol à 96% ..................................................  28 mL
Eau bidistillée ..................................................  54,5 mL
Mouillant (détergent vaisselle) ............................ 0,5 mL

Selon Bart Buyck (Bull. SMNF t. 105, fasc. 1) ce réactif, par ses réactions métachromatiques, permet de mettre en évidence, sur des coupes fines (sinon elles sont illisibles), les laticifères, les dermatocystides, les poils du revêtement, les incrustations sur les parois des hyphes…

Autre avantage : la présence de glycérine permet d'obtenir des préparations semi-permanentes qui permettent de comparer des préparations sans avoir à rechercher et à retravailler les exsiccata originaux.

Actuellement peu utilisé, ce réactif mérite d'être plus valorisé et fera très certainement partie, dans quelques temps, des produits de routine du laboratoire, il permet parfois des observations se qualité supérieure à celles dans le Rouge Congo. Sa conservation en flacon bien fermé est de 2 ans.

Le bleu de crésyl aqueux à 1‰

peut être utilisé pour réaliser des colorations vitales, cette concentration très faible n'étant pas immédiatement létale pour les cellules.

e) Le Bleu de toluidine en solution à 1% dans l’eau bidistillée

Ce colorant a été utilisé par GRUBE (1993) pour étudier les asques et les hyphes végétatives des thalles lichéniques, il permet aussi de colorer les hyphes des divers champignons lichénicoles non lichénisés et les conidies.

Ce colorant est toutefois extrêmement toxique et nous déconseillons son emploi, les hyphes des lichénicoles et les conidies pouvant être mises en évidence par le bleu de crésyl (qui lui est peu toxique).